1. При подсчете микроорганизмов, культуральные среды (разбавители) или их разведения, разливают в количествах, превышающих 9 мл. Вместимость пробирок, колб или флаконов должна быть соответственно указана.

2. Жидкую испытуемую пробу встряхивают в руке, производя 25 движений вверх и вниз с амплитудой около 30 см за 7 с. Пипеткой отбирают 1мл исследуемой пробы и вносят его в 9 мл разбавителя, избегая контакта пипетки с разбавителем. Осторожно смешивают исследуемую порцию с разбавителем путем десятикратного втягивания другой пипеткой или в механическом смесителе в течение 5-10 с. Частоту вращения смесителя надо подбирать так, чтобы жидкость, которая образует воронку, не доходила до края сосуда на 2-3 см. Конкретный способ смешивания указан в стандарте, касающемся изучаемого продукта.

3. Другие продукты. Взвешивают навеску испытуемой пробы массой (10±0,01) г или массой, кратной 10 г в резервуаре вращательного встряхивателя или в пластиковой емкости, достаточной для выполнения исследования и приготовления всех дальнейших разведений, требуемых специальным стандартом для исследуемого продукта.

Добавляют объем разбавителя, равный 9 мл или кратный 9 мл. Вращательный встряхиватель используют в течение времени, достаточного для того, чтобы получить от 15000 до 20000 оборотов, но не более 2,5 мин.

4. Дальнейшие десятикратные разведения. В случае исследования на наличие или отсутствие микроорганизмов в 0,1 мл или 0,1 г продукта готовят следующие разведения.

Переносят чистой пипеткой (если смесь исходной суспензии была получена пипеткой, используют ту же пипетку) 1 мл исходной суспензии (первичное 1+9 (10 -1) разведение в другую пробирку, содержащую 9 мл стерильного разбавителя, избегая контакта пипетки с разбавителем.

Тщательно перемешивают или путем десятикратного втягивания чистой пипеткой, или в механическом смесителе в течение 5-10 с, чтобы получить разведение 10 -2 . Частоту вращения смесителя подбирают так, чтобы жидкость во время образования воронки не доходила до краев сосуда на 2-3 см. При необходимости повторяют эти операции, т.д. до тех пор, пока не будет получено приемлемое число микроорганизмов (рисунок 1).

ПОДСЧЕТ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ПЛОТНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

1. Чашка Петри должна быть маркирована этикеткой, на которой указывают номер образца, разведение, дату посева и другую необходимую информацию.

2. Необходимо выбрать определенные разведения, чтобы обеспечить получение определенного количества колоний на чашках и преодолеть возможные ингибирующие свойства.

Для переноса каждого разведения используют отдельную стерильную пипетку, кроме случаев, когда работу ведут от самого высокого разведения к самым низким разведениям.

3. Количество чашек Петри на каждое разведение. В микробиологии пищевых продуктов обычно используют одну чашку на каждое разведение микроорганизмов согласно требованиям ISO/IEC 17025. В других случаях следует использовать две чашки для каждого разведения в соответствии с ISO 8199

МЕТОДЫ ПОСЕВА В ЧАШКИ

Посев в глубину питательной среда

1. Отбирают определенные объемы разведений для исследования, касаясь наконечником пипетки боковой стенки пробирки, чтобы удалить избыточную жидкость с внешней стороны пипетки.

2. Поднимают крышку стерильной чашки Петри так, чтобы было возможно внести содержимое пипетки в чашку.

3. Расплавленную агаровую среду выливают при температуре 44 °С - 47 °С в каждую чашку Петри. Необходимо наливать расплавленную среду таким образом, чтобы избежать ее попадания непосредственно в инокулят (посевной материал).

4. Расплавленную среду и инокулят немедленно тщательно перемешивают для получения равномерного распределения микроорганизмов в питательной среде.

6. После расплавления агаровой среды, доведенной до необходимого состояния, флакон из водяной бани высушивают сухим чистым полотенцем, чтобы предотвратить загрязнение чашек водой бани.

7. Необходимо следить, чтобы среда не попадала на внешнюю сторону флакона или на внутреннюю часть крышки чашки Петри во время разливки е чашки. Для этого флакон или колбу необходимо держать фактически в горизонтальном положении и воздержаться от возврата флакона в вертикальное положение между этапами разливки питательной среды.

8. Если в исследуемом продукте предполагается присутствие колоний (например, виды Proteus ) с "ползучим" ростом, используют для анализа слой со стерильным "голодным" агаром или идентичной питательной средой, наносимой на затвердевший агар в чашки с посеянным материалом, чтобы предотвратить или свести к минимуму распространение такого "ползучего" роста.

Поверхностный посев

1. Методы посева, предназначенные для получения только поверхностных колоний на агаровых чашках, имеют некоторые преимущества по сравнению с методом разливки в чашки для выращивания микроорганизмов внутри агара. Микроорганизмы не подвергаются действию высокой температуры расплавленной агаровой среды, поэтому количество колоний может быть выше, а подсчет - более точным.

2. Используют предварительно заполненные агаровой средой чашки, толщина агарового слоя которых составляет не менее 3 мм. Слой агара должен быть ровным и не содержать пузырьков воздуха и поверхностной влаги.

3. Чтобы облегчить равномерное распределение, поверхность затвердевшего агара необходимо подсушить в соответствии с ISO/TS 11133 или, как определено другим соответствующим международным стандартом. В таком случае посевной материал абсорбируется в течение 15 мин.

В целях реализации статьи 4.1 Федерального закона от 24 июня 1998 г. № 89-ФЗ “Об отходах производства и потребления” (Собрание законодательства Российской Федерации, 1998, № 26, ст. 3009; 2001, № 1, ст. 21; 2003, № 2, ст. 167; 2004, № 35, ст. 3607; 2005, № 19, ст. 1752; 2006, № 1, ст. 10; № 52, ст. 5498; 2007, № 46, ст. 5554; 2008, № 30, ст. 3616; № 45, ст. 5142; 2009, № 1, ст. 17; 2011, № 30, ст. 4590, № 30, ст. 4596, № 45, ст. 6333, № 48, ст. 6732; 2012, № 26, ст. 3446, № 27, ст. 3587, № 31, ст. 4317; 2013, № 30, ст. 4059, № 43, ст. 5448, № 48, ст. 6165; 2014, № 30, ст. 4220) и в соответствии с пунктом 5.2.30 Положения о Министерстве природных ресурсов и экологии Российской Федерации, утвержденного постановлением Правительства Российской Федерации от 29 мая 2008 г. № 404 (Собрание законодательства Российской Федерации, 2008, № 22, ст. 2581; № 42, ст. 4825; № 46, ст. 5337; 2009, № 3, ст. 378; № 6, ст. 738; № 33, ст. 4088; № 34, ст. 4192; № 49, ст. 5976; 2010, № 5, ст. 538; № 10, ст. 1094; № 14, ст. 1656; № 26, ст. 3350; № 31, ст. 4251, ст. 4268; № 38, ст. 4835; 2011, № 6, ст. 888, № 14, ст. 1935, № 36, ст. 5149; 2012, № 7, ст. 865; № 11, ст. 1294; № 19, ст. 2440; № 28, ст. 3905; № 37, ст. 5001; № 46, ст. 6342, № 51, ст. 7223; 2013, № 16, ст. 1964; № 24, ст. 2999; № 28, ст. 3832; № 30, ст. 4113; № 33, ст. 4386; № 38, ст. 4827; № 44, ст. 5759; № 45, ст. 5822; № 46, ст. 5944; 2014, № 2, ст. 123; № 16, ст. 1898; № 46, ст. 6366, ст. 6370), приказываю:

утвердить прилагаемые Критерии отнесения отходов к I-V классам опасности по степени негативного воздействия на окружающую среду.

Министр

С.Е. Донской

Регистрационный № 40330

Критерии
отнесения отходов к I-V классам опасности по степени негативного воздействия на окружающую среду
(утв. приказом Министерства природных ресурсов и экологии РФ от 4 декабря 2014 г. № 536)

I. Общие положения

1. Критерии отнесения отходов к I-V классам опасности по степени негативного воздействия на окружающую среду (далее - Критерии) предназначены для индивидуальных предпринимателей и юридических лиц, в процессе деятельности которых образуются отходы, а также Федеральной службы по надзору в сфере природопользования и ее территориальных органов.

2. Действие настоящих Критериев не распространяется на радиоактивные отходы, биологические отходы, медицинские отходы.

3. Критериями отнесения отходов к I-V классам опасности по степени негативного воздействия на окружающую среду являются:

степень опасности отхода для окружающей среды;

кратность разведения водной вытяжки из отхода, при которой вредное воздействие на гидробионты отсутствует.

II. Степень опасности отхода для окружающей среды

4. Степень опасности отхода для окружающей среды (К), значения которой по классам опасности отхода приведены в приложении № 1 к Критериям, определяется по сумме степеней опасности веществ, составляющих отход (далее - компоненты отхода), для окружающей среды :

,

где , , ... - показатели степени опасности отдельных компонентов отхода для окружающей среды;

m - количество компонентов отхода.

Перечень компонентов отхода и их количественное содержание устанавливаются на основании сведений, содержащихся в технологических регламентах, технических условиях, стандартах, проектной документации, либо по результатам количественных химических анализов, выполняемых с соблюдением установленных законодательством Российской Федерации об обеспечении единства измерений требований к измерениям, средствам измерений.

5. Степень опасности компонента отхода для окружающей среды рассчитывается как отношение концентрации компонента отхода к коэффициенту его степени опасности для окружающей среды .

где - концентрация i-го компонента в отходе (мг/кг);

Коэффициент степени опасности i-го компонента отхода для окружающей среды (мг/кг).

6. Коэффициентом степени опасности компонента отхода для окружающей среды является показатель, численно равный количеству компонента отхода, ниже значения которого он не оказывает негативного воздействия на окружающую среду. Размерность коэффициента степени опасности для окружающей среды условно принимается как мг/кг.

7. Коэффициент степени опасности компонента отхода для окружающей среды рассчитывается по одной из следующих формул:

,

Унифицированный относительный параметр опасности компонента отхода для окружающей среды;

Относительный параметр опасности компонента отхода для окружающей среды.

8. Относительный параметр опасности компонента отхода для окружающей среды рассчитывается по формуле:

,

где - значение балла, соответствующее каждому оцененному первичному показателю опасности компонента отхода;

n - количество оцененных первичных показателей опасности компонента отхода;

Значение балла, соответствующее показателю информационного обеспечения системы первичных показателей опасности компонента отхода.

9. Первичные показатели опасности компонента отхода характеризуют степени их опасности для различных компонентов природной среды и представлены в приложении № 2 к Критериям.

10. Значения баллов , соответствующие показателю информационного обеспечения, определяемого путем деления числа оцененных первичных показателей опасности компонента отхода (n) на 12, присваивается интервалам его изменения согласно приложению № 3 к Критериям.

11. Компоненты отходов, состоящие из таких химических элементов как кислород, азот, углерод, фосфор, сера, кремний, алюминий, железо, натрий, калий, кальций, магний, титан в концентрациях, не превышающих их содержание в основных типах почв, относятся к практически неопасным компонентам отходов с относительным параметром опасности компонента отхода для окружающей среды , равным 4, и, следовательно, коэффициентом степени опасности компонента отхода для окружающей среды , равным .

Компоненты отходов, состоящие из веществ, встречающихся в живой природе, например, таких как углеводы (клетчатка, крахмал и иное), белки, азотсодержащие органические соединения природного происхождения, относятся к практически неопасным компонентам отходов с относительным параметром опасности компонента отхода для окружающей среды , равным 4, и, следовательно, коэффициентом степени опасности компонента отхода для окружающей среды , равным .

Для остальных компонентов отходов степень опасности компонента отхода для окружающей среды определяется в соответствии с пунктами 4-10 и приложением № 1 к Критериям.

Значения коэффициента степени опасности компонента отхода для окружающей среды для наиболее распространенных компонентов отходов приведены в приложении № 4 к Критериям.

III. Кратность разведения водной вытяжки из отхода, при которой вредное воздействие на гидробионты отсутствует

12. Определение кратности (Кр) разведения водной вытяжки из отхода, при которой вредное воздействие на гидробионты отсутствует, основано на биотестировании водной вытяжки отходов - исследовании токсического действия на гидробионты водной вытяжки из отходов, полученной с использованием воды, свойства которой установлены применяемой методикой биотестирования при массовом соотношении отхода и воды 1:10.

13. Определение кратности разведения водной вытяжки из отхода, при которой вредное воздействие на гидробионты отсутствует, осуществляется по аттестованным методиках (методам) измерений, сведения о которых содержатся в Федеральном информационном фонде по обеспечению единства измерений в соответствии с Федеральным законом от 26 июня 2008 г. № 102-ФЗ “Об обеспечении единства измерений” (Собрание законодательства Российской Федерации, 2008, № 26, ст. 3021; 2011, № 30, ст. 4590, № 49, ст. 7025; 2012, № 31, ст. 4322; 2013, № 49, ст. 6339; 2014, № 26, ст. 3366).

14. При определении кратности разведения водной вытяжки из отхода, при которой вредное воздействие на гидробионты отсутствует, применяется не менее двух тест-объектов из разных систематических групп (дафнии и инфузории, цериодафнии и бактерии или водоросли), например, по смертности рачков Ceriodaphnia affinis не более 10% за 48 часов , по смертности рачков Ceriodaphnia dubia не более 10% за 24 часа или смертности рачков Daphnia magna Straus не более 10% за 96 часов и по снижению уровня флуоресценции хлорофилла и снижению численности клеток водорослей Scenedesmus quadricauda на 20% за 72 часа . За окончательный результат принимается класс опасности, выявленный на тест-объекте, проявившем более высокую чувствительность к анализируемому отходу.

При исследовании водных вытяжек из отходов с повышенным солесодержанием (содержание сухого остатка в исследуемой водной вытяжке более 6 ) применяется не менее двух тест-объектов, устойчивых к повышенному солесодержанию из разных систематических групп, например по смертности рачков Artemia salina не более 10% за 48 часов и по снижению уровня флуоресценции хлорофилла и снижению численности клеток водорослей Phaeodactylum triconutum на 20% за 72 часа .

Значения кратности разведения водной вытяжки из отхода приведены в приложении № 5 к Критериям.

VI. Применение критериев отнесения отходов к I-V классам опасности по степени негативного воздействия на окружающую среду для установления класса опасности отходов

15. Для установления класса опасности отхода применяется:

либо Критерий (1) - степень опасности отхода для окружающей среды (К),

либо Критерий (2) - кратность (Кр) разведения водной вытяжки из отхода, при которой вредное воздействие на гидробионты отсутствует.

16. Для установления классов опасности отходов, представленных золами, шлаками и золошлаковыми смесями от сжигания углей, отходов добычи и обогащения угля, и отходов, водная вытяжка из которых характеризуется повышенным солесодержанием (содержание сухого остатка в исследуемой водной вытяжке более 6 г/дм3), применяется Критерий (2).

17. В случае, если на основании применения Критерия (1) (степень опасности отхода для окружающей среды (К)) получен V класс опасности, для его подтверждения проводится проверка с применением Критерия (2) (кратность (Кр) разведения водной вытяжки из отхода, при которой вредное воздействие на гидробионты отсутствует).

При несовпадении значения класса опасности отхода, установленного на основании применения Критерия (1) (степень опасности отхода для окружающей среды (К) и применения Критерия кратность (Кр) разведения водной вытяжки из отхода, при которой вредное воздействие на гидробионты отсутствует, устанавливается класс опасности отхода на основании кратности (Кр) разведения водной вытяжки из отхода согласно приложению № 5 к Критериям.

Приложение № 1
к Критериям отнесения
отходов к I-V классам
опасности по степени
негативного воздействия на
окружающую среду,
утвержденным приказом
Министерства природных
ресурсов и экологии РФ
от 4 декабря 2014 г. № 536

Значения степени опасности отхода для окружающей среды (К) по классам опасности отхода

Класс опасности отхода	Степень опасности отхода для окружающей среды (К)
I
II
III
IV
V

Приложение № 2
к Критериям отнесения
отходов к I-V классам
опасности по степени
негативного воздействия на
окружающую среду,
утвержденным приказом
Министерства природных
ресурсов и экологии РФ
от 4 декабря 2014 г. № 536

Первичные показатели опасности компонента отхода

№ п/п	Первичные показатели опасности компонента отхода	Значения, интервалы и характеристики первичных показателей опасности компонента отхода для окружающей среды
1	* (ОДК**), мг/кг	<1	1-10	10.1-100	>100
2	Класс опасности в почве	1	2	3	не установ.
3	(ОДУ, ОБУВ), мг/л	<0.01	0.01-0.1	0.11-1	>1
4	Класс опасности в воде водных объектов, используемых для целей питьевого и хозяйственно-бытового водоснабжения	1	2	3	4
5	(ОБУВ), мг/л	<0.001	0.001-0.01	0.011-0.1	>0.1
6	Класс опасности в воде водных объектов рыбохозяйственного значения	1	2	3	4
7	( ,ОБУВ),	<0.01	0.01-0.1	0.11-1	>1
8	Класс опасности в атмосферном воздухе	1	2	3	4
9	(МДУ, МДС), мг/кг	<0.01	0.01-1	1.1-10	>10
10	Lg (S, мг/л/ , мг.л)***	>5	5-2	1.9-1	<1
11	Lg ( , /)	>5	5-2	1.9-1	<1
12	Lg ( , / или )	>7	7-3.9	3.8-1.6	<1.6
13	Lg (октанол/вода)	>4	4-2	1.9-0	<0
14	, мг/кг	<15	15-150	151-5000	>5000
15	,	<500	500-5000	5001-50000	>50000
16	, мг/л/96 ч	<1	1-5	5.1-100	>100
17		<0.1	0,1-1,0	1,0-10	>10
18	Персистентность (трансформация в окружающей среде)	Образование более токсичных продуктов, в т.ч. обладающих отдаленными эффектами или новыми свойствами	Образование продуктов с более выраженным влиянием других критериев опасности	Образование продуктов, токсичность которых близка к токсичности исходного вещества	Образование менее токсичных продуктов
19	Биоаккумуляция (поведение в пищевой цепочке)	Выраженное накопление во всех звеньях	Накопление в нескольких звеньях	Накопление в одном из звеньев	Накопление отсутствует
	Присваиваемый балл	1	2	3	4

_____________________________

* Используемые сокращения приведены в приложении № 6 к Критериям.

** В случаях отсутствия ПДК опасного компонента отхода допустимо использование другого первичного показателя, указанного в скобках.

*** Если , то lg (S/ПДК)= и балл равен 1, если S=0, то lg (S/ПДК)= и балл равен 4.

Приложение № 3
к Критериям отнесения
отходов к I-V классам
опасности по степени
негативного воздействия на
окружающую среду,
утвержденным приказом
Министерства природных
ресурсов и экологии РФ
от 4 декабря 2014 г. № 536

Значения баллов в зависимости от интервала изменения показателя информационного обеспечения

Приложение № 4
к Критериям отнесения
отходов к I-V классам
опасности по степени
негативного воздействия на
окружающую среду,
утвержденным приказом
Министерства природных
ресурсов и экологии РФ
от 4 декабря 2014 г. № 536

Коэффициент степени опасности компонента отхода для окружающей среды для отдельных компонентов отходов

Наименование компонента отхода			lg
Альдрин	1,857	2,14	2,14	138
Бенз(а)пирен	1,6	1,8	1,778	59,97
Бензол	2,14	2,52	2,52	331,13
Гексахлорбензол	2,166	2,55	2,55	354
2-4Динитрофенол	1,5	1,66	1,66	39,8
Ди(n)бутилфталат	2	2,33	2,33	215,44
Диоксины	1,4	1,533	1,391	24,6
Дихлорпропен	2,2	2,66	2,66	398
Диметилфтатат	2,166	2,555	2,555	358,59
Дихлорфенол	1,5	1,66	1,66	39,8
Дихлордифенилтрихлорэтан	2	2,33	2,33	213,8
Кадмий	2,12	2,49	2,49	309,03
Линдан	2,25	2,66	2,66	463,4
Марганец	3,15	3,87	3,87	7356,42
Медь	2,84	3,45	3,45	2840,10
Мышьяк	2,27	2,69	2,69	493,55
Нафталин	2,286	2,714	2,714	517,9
Никель	2,64	3,19	3,19	1536,97
N-нитрозодифениламин	2,8	3,4	3,4	2511,88
Пентахлорбифенилы	1,6	1,8	1,778	59,98
Пентахлорфенол	1,66	1,88	1,88	75,85
Ртуть	1,79	2,05	2,05	113,07
Стронций	3,09	3,79	3,79	6118,81
Серебро	2,14	2,52	2,52	331,1
Свинец	2,36	2,81	2,81	650,63
Тетрахлорэтан	2,4	2,866	2,866	735,6
Толуол	2,69	3,25	3,25	1778,28
Трихлорбензол	2,33	2,77	2,77	598,4
Фенол	2,28	2,71	2,71	508,94
Фураны	2,166	2,55	2,55	359
Хлороформ	2	2,333	2,333	215,4
Хром трехвалентный	2,92	3,56	3,56	3630,78
Хром шестивалентный	2,33	2,77	2,77	593,38
Цинк	2,8	3,4	3,4	2511,89
Этилбензол	2,86	3,48	3,48	3019,95

Приложение № 5
к Критериям отнесения
отходов к I-V классам
опасности по степени
негативного воздействия на
окружающую среду,
утвержденным приказом
Министерства природных
ресурсов и экологии РФ
от 4 декабря 2014 г. № 536

Значения кратности разведения водной вытяжки из отхода

Класс опасности отхода	Кратность (Кр) разведения водной вытяжки из отхода*
I	Кр > 10000
II
III
IV
V	Кр = 1

____________________________

* Для определения V класса опасности отхода используется сама водная вытяжка, без её разведения.

Приложение № 6
к Критериям отнесения
отходов к I-V классам
опасности по степени
негативного воздействия на
окружающую среду,
утвержденным приказом
Министерства природных
ресурсов и экологии РФ
от 4 декабря 2014 г. № 536

Перечень сокращений

(мг/кг)	Предельно допустимая концентрация вещества в почве
ОДК (мг/кг)	Ориентировочно допустимая концентрация
(мг/л)	Предельно допустимая концентрация вещества в воде водных объектов, используемых для целей питьевого и хозяйственно-бытового водоснабжения
ОДУ (мг/л)	Ориентировочно допустимый уровень
ОБУВ (мг/л)	Ориентировочный безопасный уровень воздействия
(мг/л)	Предельно допустимая концентрация вещества в воде водных объектов рыбохозяйственного значения
	Предельно допустимая концентрация вещества среднесуточная в атмосферном воздухе населенных мест
(мг/кг)	Предельно допустимая концентрация вещества в пищевых продуктах
	Предельно допустимая концентрация вещества максимально разовая в атмосферном воздухе населенных мест
	Предельно допустимая концентрация вещества в атмосферном воздухе рабочей зоны
МДС (мг/кг)	Максимально допустимое содержание
МДУ (мг/кг)	Максимально допустимый уровень
S (мг/л)	Растворимость компонента отхода (вещества) в воде при 20°С
	Насыщающая концентрация вещества в воздухе при 20°С и нормальном давлении
	Коэффициент распределения в системе октанол/вода при 20°С
(мг/кг)	Средняя смертельная доза компонента в миллиграммах действующего вещества на 1 кг живого веса, вызывающая гибель 50% подопытных животных при однократном пероральном введении в унифицированных условиях
(мг/л/96 ч)	Средняя смертельная концентрация вещества в воде, вызывающая гибель 50% всех взятых в опыт гидробионтов (например, рыб) через 96 часов
	Средняя смертельная концентрация вещества, вызывающая гибель 50% подопытных животных при ингаляционном поступлении в унифицированных условиях
	Биологическая диссимиляция
	Биологическое потребление кислорода, выраженное в миллилитрах за 5 суток
ХПК	Химическое потребление кислорода, выраженное в миллилитрах л

Обзор документа

Утверждены Критерии отнесения отходов (кроме радиоактивных, биологических и медицинских) к I-V классам опасности по степени негативного воздействия на окружающую среду.

Критерии предназначены для ИП и юрлиц, в процессе деятельности которых образуются отходы, а также Росприроднадзора и его территориальных органов.

Выделяют 2 критерия: степень опасности отхода для окружающей среды и кратность разведения водной вытяжки из отхода, при которой вредное воздействие на гидробионты отсутствует.

Степень опасности отхода определяется по сумме степеней опасности его компонентов. Степень опасности компонента рассчитывается как отношение концентрации компонента к коэффициенту его степени опасности. Коэффициентом является показатель, численно равный количеству компонента, ниже значения которого он не оказывает воздействия.

Определение кратности основано на биотестировании водной вытяжки отходов. Оно состоит в исследовании токсического действия на гидробионты водной вытяжки из отходов, полученной с использованием воды, свойства которой установлены применяемой методикой биотестирования при массовом соотношении отхода и воды 1:10.

По общему правилу для установления классов может применяться любой из указанных критериев.

При этом для отходов, представленных золами, шлаками и золошлаковыми смесями от сжигания углей, отходов добычи и обогащения угля, и отходов, водная вытяжка из которых характеризуется повышенным солесодержанием (содержание сухого остатка в исследуемой водной вытяжке более 6 г/дмЗ), применяется второй критерий.

Если на основании применения первого критерия получен V класс опасности, то для его подтверждения проводится проверка с применением второго.

При несовпадении значения класса он устанавливается на основании второго критерия.

Определение класса опасности отходов методом биотестирования

Среди животных на клеточном уровне организации наиболее важное индикаторное значение имеют дафнии. Преимущество перед другими группами простейших (саркодовые и жгутиконосцы) они имеют потому, что видовой состав и численность их наиболее четко соответствуют каждому уровню сапрофобности среды, они отличаются высокой чувствительностью к изменениям внешней среды и отчетливо выраженной реакцией на эти изменения, имеют относительно крупные размеры и быстро размножаются. Используя эти особенности дафний, можно с известной степенью точности установить уровень сапробности водной среды, не привлекая для этой цели другие индикаторные организмы .

Определение токсичности воды и водных вытяжек из отходов по смертности дафний

Методическое руководство включает методики биотестирования с использованием в качестве тест-объектов ракообразных, водорослей.

Методика основана на определении изменений выживаемости и плодовитости дафний при воздействии токсических веществ, содержащихся в тестируемой воде по сравнению с контролем.

Кратковременное биотестирование -- до 96 ч -- позволяет определить острое токсическое действие воды на дафний по их выживаемости. Показателем выживаемости служит среднее количество тест-объектов, выживших в тестируемой воде или в контроле за определенное время. Критерием острой токсичности является гибель 50 и более процентов дафний за период времени до 96 часов в исследуемой воде при условии, что в контрольном эксперименте гибель не превышает 10%.

В экспериментах по определению острого токсического действия устанавливают среднюю летальную концентрацию отдельных веществ, вызывающую гибель 50% и более тест-организмов (ЛКР) и безвредную концентрацию, вызывающую гибель не более 10% тест-организмов (БКР).

Длительное биотестирование--20 и более суток -- позволяет определить хроническое токсическое действие воды на дафний по снижению их выживаемости и плодовитости. Показателем выживаемости служит среднее количество исходных самок дафний, выживших в течение биотестирования. Критерием токсичности является достоверное отличие от контроля показателя выживаемости или плодовитости дафний.

Исходный материал для культивирования (дафнии) получают в лабораториях, занимающихся биотестированием, имеющих культуру требуемой видовой принадлежности (Daphnia magna Straus).

Биотестирование воды и водных вытяжек проводится только на синхронизированной культуре дафний. Синхронизованной является одновозрастная культура, полученная от одной самки путем ациклического партеногенеза в третьем поколении. Такая культура генетически однородна. Рачки, ее составляющие, обладают близкими уровнями устойчивости к токсическим веществам, одновременно созревают и в одно время дают генетически однородное потомство. Получают синхронизированную культуру путем отбора одной самки средних размеров с выводковой камерой, заполненной эмбрионами, и помещают в химический стакан объемом 250 мл, заполненного культивационной водой на 200 мл. Появившаяся молодь переносится в кристаллизатор (25 особей на 1 дм воды) и культивируется. Полученная третья генерация является синхронизированной культурой и может быть использована для биотестирования.

Дафниям необходимо обеспечить комбинированное дрожже-водорослевое питание. В качестве корма используются зеленые водоросли родов Chlorella, Scenedesmus, Selenastrum.

Культивируют водоросли в стеклянных кюветах, батарейных стаканах или плоскодонных колбах при круглосуточном освещении лампами дневного света 3000 лк и постоянном продувании культуры воздухом с помощью микрокомпрессоров. Через 7--10 суток, когда окраска культуры водорослей становится интенсивно зеленой, их отделяют от питательной среды путем центрифугирования или отстаивания в холодильнике в течение 2--3 сут. Осадок разбавляют в два раза дистиллированной водой. Суспензию хранят в холодильнике не более 14 сут.

Для приготовления дрожжевого корма 1 г свежих или 0,3 г воздушно-сухих дрожжей заливают 100 мл дистиллированной воды. После набухания дрожжи тщательно перемешивают. Образовавшуюся суспензию отстаивают в течение 30 мин. Недостающую жидкость добавляют в сосуды с дафниями в количестве 3 мл на 1 л воды. Раствор дрожжей хранится в холодильнике до двух суток.

Дафний в остром опыте кормят ежедневно, один раз в сутки, добавляя 1,0 см концентрированной или разбавленной в два раза дистиллированной водой водорослевой суспензии на 100 см культивационной воды.

В хроническом опыте дополнительно добавляют 1-2 раза в неделю 0,1-0,2 см дрожжевой суспензии на 100 см воды.

Пробы сточной воды для биотестирования отбирают, руководствуясь инструкцией по отбору проб для анализа сточных вод НВН 33-5.3.01-85; отраслевыми стандартами или другими нормативными документами. Пробы природной воды отбирают, руководствуясь ГОСТ 17.1.5.05-85. Отбор проб грунта, транспортировка и хранение осуществляется в соответствии с ГОСТ 12071-84.

Биотестирование проб воды проводят не позднее 6 ч после их отбора. Если указанный срок не может быть соблюден, пробы хранят до двух недель с открытой крышкой внизу холодильника (при +4°С). Не допускается консервирование проб с помощью химических консервантов. Перед биотестированием пробы фильтруют через фильтровальную бумагу с размером пор 3,5--10 мкм.

Для проведения биотестирования из отобранных проб осадков сточных вод и отходов готовят водную вытяжку, для этого в сосуд для выщелачивания, где находится взвешенная воздушно-сухая масса отхода или осадка сточных вод с абсолютно-сухой массой 100±1 г, добавляется вода, используемая для культивирования. Вода добавляется в соотношении 1000 см воды на 100 г абсолютно-сухой массы.

Смесь должна перемешиваться слабо на мешалке в течение 7-8 часов таким образом, чтобы твердое вещество находилось во взвешенном состоянии. Недопустимо измельчение частиц отходов или осадков при перемешивании. Используется магнитная мешалка, а скорость перемешивания должна быть наименьшей, при котором материал поддерживается во взвешенном состоянии.

После окончания перемешивания раствор с осадком оставляют на 10-12 часов для отстаивания. Затем жидкость над осадком сифонируется.

Фильтрация осуществляется через фильтр «белая лента» на воронке Бюхнера с применением слабого вакуума.

Процедура биотестирования проводится не раньше чем через 6 ч после приготовления вытяжки из осадка, отхода. Если это невозможно, то допускается хранение экстракта в холодильнике не более 48 ч.

Водная вытяжка должна иметь рН=7,0-8,2. При необходимости пробы нейтрализуют. После нейтрализации пробы аэрируют 10-20 мин. Перед биотестированием температуру пробы доводят до 20 ± 2С.

Для определения острого токсического действия проводят биотесирование исходной исследуемой воды или водной вытяжки из почвы, осадков сточных вод, отходов и нескольких их разбавлений.

Определение токсичности каждой пробы без разбавления и каждого разбавления проводится в трех параллельных сериях. В качестве контроля используется три параллельные серии с культивационной водой.

Биотестирование проводится в химических стаканах объемом 150-200 см, которые заполняются 100 см исследуемой воды, в них помещают по десять дафний в возрасте 6-24 ч. Чувствительность дафний к токсикантам зависит от возраста рачков. Возраст определяется по размеру рачков и обеспечивается фильтрацией рачков через набор сит. Дафний отлавливают из культиваторов, в которых выращивается синхронизированная культура. В отдельный стакан отсаживают одновозрастных рачков после их фильтрации через набор сит, а затем отлавливают по одному пипеткой (с опиленным и опаленным концом) объемом 2 см с резиновой грушей и сажают в стакан с исследуемой водой.

Посадку дафний начинают с контрольной серии. В исследуемые растворы дафний помещают, начиная с больших разбавлений (меньших концентраций загрязняющих веществ) к меньшим разбавлениям. Для работы с серией контроля должен быть отдельный сачок.

Для каждой серии исследуемой воды используется 3 химических стакана.

Учет смертности дафний в опыте и контроле проводят через каждый час до конца первого дня опыта, а затем 2 раза в сутки ежедневно до истечения 96 часов.

Неподвижные особи считаются погибшими, если не начинают двигаться в течение 15 секунд после легкого покачивания стакана.

Если гибель дафний в контроле превышает 10%, результаты опыта не учитывают, и он должен быть повторен.

Для определения острой токсичности исследуемых вод, водной вытяжки рассчитывается процент погибших в тестируемой воде дафний по сравнению с контролем:

где Х- количество выживших дафний в контроле; Х- количество выживших дафний в тестируемой воде; А- процент погибших дафний в тестируемой воде.

При А?10% тестируемая вода или водная вытяжка не оказывает острого токсического действия (БКР). При А?50% тестируемая вода, водная вытяжка оказывает острое токсическое действие (ЛКР).

Если экспериментально не удается установить точного значения кратности разбавления, вызывающей 50% гибель дафний за 96 часов экспозиции, то для получения точного значения ЛКР без выполнения дополнительных экспериментов, используется графический или неграфический метод определения.

При графическом методе определения ЛКР, чтобы получить на графике линейную зависимость, используется пробит анализ. Результаты экспериментов по установлению острого токсического действия из рабочего журнала заносят в таблицу 1. Значения пробитов устанавливают по таблице 2. В таблицу 3 вносятся значения пробитов для экспериментально установленного процента гибели дафний и значения десятичных логарифмов для исследованных концентраций сточных вод, водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов.

По значениям пробитов (таблица 2.8) и десятичных логарифмов от экспериментально полученных данных (таблица 2.7) строится график, по оси абсцисс откладываются значения логарифмов процентных концентраций исследуемых вод, по оси ординат - пробиты от значений процента гибели дафний. Экспериментальные данные вносятся в систему координат, и через точки проводится прямая.

На графике параллельно оси логарифмов концентраций (lgС) проводится прямая из точки, соответствующей пробитному значению 5, что соответствует 50% гибели дафний (из таблицы 2). Из точки пересечения прямых с графиком зависимости пробитного значения ингибирования тест-параметра от логарифма концентраций и получают значение логарифма концентраций исследуемых вод, водных вытяжек, соответствующих ЛКР.

Полученные данные биотестирования вносятся в таблицу, форма записи которой представлена в таблице 2.7

Таблица- 2.7 Форма записи результатов определения острой токсичности сточной воды

Значения пробитов для экспериментального устанавливаемой гибели дафний от 0 до 99 % представлены в таблице 2.8

Таблица -2.8 Значение пробитов

При неграфическом методе определения ЛКР десятичный логарифм концентрации исследуемых сточных вод обозначается за х, а численные значения пробитов гибели дафний - у. В результате получаем линейную зависимость:

Численные значения коэффициентов k и b вычисляются по формулам:

Полученный логарифм процентной концентрации исследуемой воды (lgC) переводится в процентную концентрацию. Безвредная кратность разбавления (БКР10-96) рассчитывается путем деления 100% на полученную процентную концентрацию.

Класс опасности устанавливается по кратности разведения водной вытяжки, при которой не выявлено воздействие на гидробионтов в соответствии со следующими диапазонами кратности разведения в соответствие с таблицей 2.8

Таблица- 2.8 Показатели кратности разведения водной вытяжки

Результаты определения класса опасности.

После проведения ряда экспериментов получены следующие данные по установлению класса опасности для предприятий города Саратова и Энгельса.

Опыт, поставленный на тест-объектах дафнии с целью установления изменения их плодовитости для предприятия ОАО СЭМЗ «Электродеталь», дал следующие результаты, предоставленные в таблице 2.9. Исходя из полученных данных рассчитаны ИКР50-96 равная 219,3, что соответствует острой токсичности отхода и БКР10-96 равная 1466,2 значение которой лежит в интервале от 10000 до 1001, что соответствует 2 классу опасности в соответствии с таблицей 2.8 методики.

Опыт, поставленный на тест-объектах дафнии для предприятия ОАО Завод «Газпроммаш», дал следующие результаты, предоставленные в таблице 2.10. Исходя из полученных данных рассчитаны ИКР50-96 равная 312,6, что соответствует острой токсичности отхода и БКР10-96 равная 910,7 значение которой лежит в интервале от 1000 до 101, что соответствует 3 классу опасности в соответствии с таблицей 2.8 методики.

Опыт, поставленный на тест-объектах дафнии для предприятия ОАО «Саратовский НПЗ», дал следующие результаты, предоставленные в таблице 2.11. Исходя из полученных данных рассчитаны ИКР50-96 равная 3,8, следовательно не оказывает острого токсического действия и БКР10-96 равная 13,7 значение которой лежит в интервале от 1 до 100, что соответствует 4 классу опасности в соответствии с таблицей 2.8 методики.

Опыт, поставленный на тест-объектах дафнии для предприятия ЗАО «Факс-Авто», дал следующие результаты, предоставленные в таблице 2.12. Исходя из полученных данных рассчитаны ИКР50-96 равная 0,95, следовательно не оказывает острого токсического действия и БКР10-96 равная 1,61 значение которой лежит в интервале от 1 до 100, что соответствует 4 классу опасности в соответствии с таблицей 2.8 методики.

Опыт, поставленный на тест-объектах дафнии для предприятия ОАО АТП-2, дал следующие результаты, предоставленные в таблице 2.13. Исходя из полученных данных рассчитаны ИКР50-96 равная 0,49, следовательно не оказывает острого токсического действия и БКР10-96 равная 1,001 значение которой лежит в интервале?1, что соответствует 5 классу опасности в соответствии с таблицей 2.8 методики.

Опыт, поставленный на тест-объектах дафнии для предприятия ОАО СГАТП-6, дал следующие результаты, предоставленные в таблице 2.14. Исходя из полученных данных рассчитаны ИКР50-96 равная 0,199, следовательно не оказывает острого токсического действия и БКР10-96 равная 0,409 значение которой лежит в интервале?1, что соответствует 5 классу опасности в соответствии с таблицей 2.8 методики.

Приказ Минприроды России от 04.12.2014 N 536 "Об утверждении Критериев отнесения отходов к I - V классам опасности по степени негативного воздействия на окружающую среду" (Зарегистрировано в Минюсте России 29.12.2015 N 40330)

III. Кратность разведения водной вытяжки из отхода, при которой вредное воздействие на гидробионты отсутствует

III. КРАТНОСТЬ РАЗВЕДЕНИЯ ВОДНОЙ ВЫТЯЖКИ ИЗ ОТХОДА,

ПРИ КОТОРОЙ ВРЕДНОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ НА ГИДРОБИОНТЫ ОТСУТСТВУЕТ

12. Определение кратности (Кр) разведения водной вытяжки из отхода, при которой вредное воздействие на гидробионты отсутствует, основано на биотестировании водной вытяжки отходов - исследовании токсического действия на гидробионты водной вытяжки из отходов, полученной с использованием воды, свойства которой установлены применяемой методикой биотестирования при массовом соотношении отхода и воды 1:10.

13. Определение кратности разведения водной вытяжки из отхода, при которой вредное воздействие на гидробионты отсутствует, осуществляется по аттестованным методикам (методам) измерений, сведения о которых содержатся в Федеральном информационном фонде по обеспечению единства измерений в соответствии с Федеральным законом от 26 июня 2008 г. N 102-ФЗ "Об обеспечении единства измерений" (Собрание законодательства Российской Федерации, 2008, N 26, ст. 3021; 2011, N 30, ст. 4590, N 49, ст. 7025; 2012, N 31, ст. 4322; 2013, N 49, ст. 6339; 2014, N 26, ст. 3366).

14. При определении кратности разведения водной вытяжки из отхода, при которой вредное воздействие на гидробионты отсутствует, применяется не менее двух тест-объектов из разных систематических групп (дафнии и инфузории, цериодафнии и бактерии или водоросли), например, по смертности рачков Ceriodaphnia affinis не более 10% за 48 часов (БКР10-48 ), по смертности рачков Ceriodaphnia dubia не более 10% за 24 часов (БКР10-24 ) или смертности рачков Daphnia magna Straus не более 10% за 96 часов (БКР10-96 ) и по снижению уровня флуоресценции хлорофилла и снижению численности клеток водорослей Scenedesmus quadricauda на 20% за 72 часа (БКР20-72 ). За окончательный результат принимается класс опасности, выявленный на тест-объекте, проявившем более высокую чувствительность к анализируемому отходу.

При исследовании водных вытяжек из отходов с повышенным солесодержанием (содержание сухого остатка в исследуемой водной вытяжке более 6 г/дм3 ) применяется не менее двух тест-объектов, устойчивых к повышенному солесодержанию из разных систематических групп, например по смертности рачков Artemia salina не более 10% за 48 часов (БКР10-48 ) и по снижению уровня флуоресценции хлорофилла и снижению численности клеток водорослей Phaeodactylum tricomutum на 20% за 72 часа (БКР20-72 ).